Een erg belangrijke techniek in de moleculaire biologie is het sequencen. Sanger sequencing is vanaf 1980 voor de meeste laboratoria een standaard methode geworden. Sanger sequencing word ook wel dideoxy sequencing genoemd, door het gebruik van dideoxynucleotiden. In vergelijking tot normale nucleotiden, bevatten dideoxynucleotiden een waterstofgroep op de 3' koolstof. Op deze plaats zit normaal gesproken een hydroxylgroep. Maar hoe zit het dan verder met Sanger sequencing? Dit lees je in dit artikel. Naast Sanger sequencing bestaat er ook pyrosequencing en tegenwoordig ook Next Generation Sequencing (NGS). Deze technieken produceren meer en sneller data dan Sanger sequencing. Met NGS kan je zelfs in één keer bijvoorbeeld het hele exome of transcriptoom van een organisme bepalen. Op deze laatste twee sequencemethode gaan we in dit artikel niet in, vanwege de complexiteit.
Wat is Sanger DNA sequencing?
Door middel van sequencing kan de primaire structuur van DNA bepaald worden, dus de volgorde van de basen. Deze veel gebruikte sequence methode maakt gebruik van de “chain termination method”. Deze methode is ontwikkeld door Frederick Sanger en wordt daarom ook Sanger sequencing genoemd. De chain termination methode gebruikt specifieke terminatie (beëindiging) van een DNA synthese reactie.
Voorafgaand aan Sanger sequencing wordt een PCR uitgevoerd en met één van de primers kan één sequence reactie uitgevoerd worden. Zie http://artikelen.foobie.nl/verslagen-scripties/polymerase-chain-reaction-pcr/ voor verdere informatie over DNA en PCR. Het enzym DNA polymerase zorgt ervoor dat de primer verlengd wordt. Dit enzym repliceert DNA. Voordat het DNA gesequenced kan worden, moet het DNA eerst worden gedenatureerd. Daarna wordt de primer vastgehecht aan de template. Deze primer is speciaal ontworpen zodat het 3' uiteinde naast het DNA ligt waar je interesse in hebt. Deze primer moet worden gelabeld. Dit kan zowel radioactief als fluorescent. Tegenwoordig wordt er meer met fluorescente labeld gewerkt. De oplossing wordt verdeeld in vier buisjes, met de labels “G”, “A”, “T” en “C”.
Hierbij moeten ook de vier dideoxynucleotiden toegevoegd worden. De dideoxynucleotiden zijn aanwezig met ongeveer een honderdste van de concentratie van de normale voorlopers. De dideoxynucleotiden verhinderen toevoeging van nog meer nucleotiden. Dit gebeurd doordat een fosfodiester binding niet gevormd kan worden tussen de dideoxynucleotide en het volgend komende nucleotide. Omdat het DNA wordt gesynthetiseerd, worden nucleotiden toegevoegd aan de groeiende keten van het DNA-polymerase. Af en toe wordt er een dideoxynucleotide opgenomen in de keten in plaats van een normaal nucleotide. Hierdoor wordt dus de DNA ketting beëindigd.
Banden van allrlei verschillende lengtes worden geproduceerd. Wanneer de reacties compleet zijn, wordt het DNA opnieuw gedenatureerd, voorafgaande aan de elektroforese. De vier buizen worden in een aparte laan op de polyacrylmide gel geladen, om zo de verschillende lengtebanden te kunnen onderscheiden van elkaar. Naast het gebruik van een polyacrylmide gel, kan er ook gebruik worden gemaakt van een capillair. De is gevuld met een viskeuze polymeer. Tegenwoordig wordt deze laatste methode het meest gebruikt.
“Dye Terminator Sequencing”
In plaats van de primers te labelen, kunnen ook de terminatoren gelabeld worden. Dit wordt ook wel “Dye Terminator Sequencing” genoemd. Hierdoor kan een hele set in één reactie uitgevoerd worden. Dit in tegenstelling tot de methode die primer-labeling gebruikt en er vier reactie's nodig zijn. Iedere ketting-terminator kan gelabeld worden met een andere fluorescerende kleurstof. Deze methode wordt het meeste gebruikt, omdat het sneller en goedkoper is. Zoals in de inleiding vermeld, zijn er nu recenter ontworpen sequence technieken op de markt gebracht, die nog sneller en nog effeciënter (hierdoor ook goedkoper) zijn.
