Om huidkanker op tijd te kunnen detecteren en behandelen zijn er DNA-technieken nodig. Een mogelijke DNA-techniek is RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism. In dit essay wordt nagegaan of RFLP een bruikbare techniek is bij het opsporen van huidkanker. Hiervoor moet men weten hoe huidkanker ontstaat en wat het moleculaire mechanisme erachter is. Vervolgens wordt het mechanisme van RFLP besproken en hoe hiermee mutaties opgespoord kunnen worden. Tot slot wordt geprobeerd een antwoord te vinden op de onderzoeksvraag: ‘Hoe ontstaat huidkanker en is dit te detecteren met RFLP?’
Hoe ontstaat huidkanker?
Huidkanker is een veel voorkomende ziekte, die meestal niet gevaarlijk is. Als het echter wel gevaarlijk is, is er een groot probleem. Er zijn drie vormen van huidkanker die alle drie voorkomen in de opperhuid. De drie vormen zijn Basaalcelcarcinoom, plaveiselcelcarcinoom en melanoom. Basaalcelcarcinoom is van deze drie de minst gevaarlijke, omdat het zelden uitzaait en niet snel groeit. Het kan genezen worden door middel van het operatief verwijderen van de aangetaste plek. Plaveiselcelcarcinoom (Engels: Squamous cell carcinoma) is een iets ernstigere vorm van huidkanker, omdat het vrij snel groeit en uitzaait. Bij een tijdige behandeling is volledige genezing echter mogelijk. Melanoom is de gevaarlijkste soort huidkanker, omdat het snel groeit en snel uitzaait. Als het op tijd ontdekt wordt, is het door operatie nog te genezen. Bij een te late constatering is de kans op uitzaaiing echter groot, waardoor er met chemokuren nog een poging tot genezing gewaagd kan worden, maar de kans hierop is vrij klein. In figuur 1 is te zien waar de verschillende soorten huidkanker voorkomen.
Het lijkt erop dat veel huidkankersoorten bevorderd worden door UV-licht, alhoewel dat niet de enige oorzaak hoeft te zijn. Basaalcelcarcinoom en melanoom lijken vaak veroorzaakt te worden door kortdurende, maar hevige blootstelling aan UV-licht. Bij plaveiselcelcarcinoom lijkt juist langdurigere blootstelling aan minder heftig UV-licht de oorzaak, of in ieder geval een medeoorzaak. Ook zijn sommige mensen gevoeliger voor de zon dan anderen en hebben daarmee een grotere kans op huidkanker. Dit is bijvoorbeeld het geval bij mensen met albinisme en mensen met een Keltische oorsprong. Kennelijk zit er dus ook een erfelijke factor in de kans op huidkanker.
De moleculaire oorsprong van met name plaveiselcelcarcinoom lijkt in UV licht te zitten. Uit een onderzoek van Brash et al. (1991) blijkt dat in plaveiselcelcarcinomen vooral de volgende puntmutaties te vinden zijn: C→T en CC→TT. Deze mutaties staan erom bekend dat ze veroorzaakt worden door UV-licht. Dit wordt versterkt door het feit dat bij vergelijkbare mutaties in het p53-gen in de huid en in de rest van het lichaam, vooral in de huid de bovenstaande mutaties te vinden zijn, en in de rest van het lichaam andere mutaties. Met name UVB-licht is gevaarlijk, omdat UVA-licht niet sterk genoeg is, en UVC-licht niet door de ozonlaag heen komt. Het UV-licht zorgt voor pyrimidine-dimeren (zie afbeelding)
Door deze mutatie kan op die plaats het DNA niet meer afgelezen worden. Omdat DNA-polymerase een voorkeur heeft voor het neerzetten van A-nucleotiden op een plaats waar er geen template beschikbaar is, komen er dus tegenover de pyrimidinedimeren A-nucleotiden. Dit levert geen problemen op bij een thymine dimeer, maar als dit bij een cytosine dimeer gebeurt, zal er bij de volgende ‘generaties’ DNA op dezelfde streng thymine komen in plaats van cytosine. Door deze mutatie kan het p53 gen niet goed meer afgelezen worden, en wordt het p53 eiwit verkeerd aangemaakt.
Het p53-gen is een tumor-suppressorgen. Het eiwit waarvoor het codeert heeft een remmende werking op de celdeling. Het gen wordt aangeschakeld als er iets in de cel verkeerd is, bijvoorbeeld bij DNA-schade. Het p53-eiwit activeert vervolgens andere genen, bijvoorbeeld p21. Dit is een gen dat codeert voor een eiwit dat de celcyclus stillegt, door aan CDK te binden. Ook activeert p53 genen die direct in DNA-reparatie betrokken zijn. Als de DNA-schade niet meer te repareren is, kan het p53-eiwit ervoor zorgen dat de genen die betrokken zijn bij apoptose ingeschakeld worden. Het p53 gen is dus zeer belangrijk in het voorkomen van tumoren, omdat het voorkomt dat een cel zich deelt als er DNA-schade is.
Is de DNA-schade ín het p53 gen, zoals hierboven beschreven, dan kan de cel niet meer controleren of andere genen beschadigd zijn, waardoor beschadigde cellen dus zullen blijven delen. Zo kunnen andere mutaties ongezien blijven en in volgende generaties van de cel aanwezig blijven. Bij ongeveer 7 mutaties in een cel zal de cel een kankercel worden en zich ongeremd gaan delen. Door deze ongeremde deling zal een tumor ontstaan. Gebeurt dit in de huid, dan ontstaat er huidkanker.
Huidkanker is op zich niet gevaarlijk, maar als de tumorcellen in de bloedbaan of lymfebaan komen en zich ergens anders gaan nestelen, kunnen er ook tumoren in andere organen ontstaan. Als deze erg groot worden, kan de functie van het orgaan achteruitgaan, of zelfs helemaal verdwijnen. Een patiënt zal dan overlijden. Om dit te voorkomen is het belangrijk om huidkanker in een vroeg stadium te detecteren. Dit kan gedaan worden met DNA-technieken. Eén van die technieken is RFLP.
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) is het verschil in lengte tussen homologe stukken DNA. Deze verschillende lengtes worden veroorzaakt doordat er in het DNA op specifieke plekken geknipt wordt. Om het DNA op te knippen tot losse DNA stukken van verschillende lengtes wordt gebruikt gemaakt van restrictie-enzymen. Deze enzymen zijn afkomstig uit bacteriën en herkennen zeer specifieke palindrome nucleotidesequenties in het DNA, restrictie-sites, waar het DNA geknipt moet worden (afbeelding: http://t1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRAS-3a0tO6qdHdwmRXCjTsgaknDZevBUVUsnJfFY0rsGqMTv8&t=1&usg=__7yDVAgdUgxL6LSGaXCif9g4fFrI=).
Bij verandering van slechts één nucleotide in een restrictie-site zal het restrictie-enzym deze plek al niet meer herkennen. Daardoor zal dus op deze plaats niet meer geknipt worden.
Na de DNA fragmentatie worden de stukken DNA op lengte gescheiden door de techniek agarose gelelektroforese. De negatief geladen stukken DNA banen zich hierbij een weg door een gel naar een pluspool waarbij de kleinere stukken sneller bij de pluspool aanbeland zijn dan de grotere stukken. Als de kleinste deeltjes helemaal onderaan de gel zijn beland, wordt de stroom van de gel afgehaald om hierna volgens de Southern Blot procedure de DNA-fragmenten naar een nitrocellulose membraan te brengen. Eerst wordt de gel gespoeld met NaOH om het DNA enkelstrengs te maken. Daarna wordt het membraan bovenop de gel gelegd en met behulp van capillariteit wordt het DNA van de gel overgebracht op het membraan. Het bepalen van de lengtes van de DNA stukken gebeurt uiteindelijk door middel van hybridisatie van het DNA aanwezig op het membraan (DNA target) met een fluorescerende DNA probe. Dit bestaat uit stukken DNA die complementair zijn aan die van het DNA target en op een specifieke plek aan de DNA target bindt. De DNA target en de DNA probe vormen waterstofbruggen met elkaar (dit proces heet annealing) en er ontstaat een dubbelstrengs stuk DNA. Er is sprake van RFLP als er een verschil is in lengte tussen de stukken DNA (verschillende allelen) van verschillende individuen.
Verschillende allelen binnen een soort ontstaan door onschuldige veranderingen in het DNA, polymorfismen (de term ‘mutaties’ wordt vaak gebruikt om schadelijke veranderingen aan te geven). Als één basenpaar verandert, kan er een restrictiesite verdwijnen of juist ontstaan. In figuur 4 zijn twee stukken enkelstrengs DNA te zien, A en a. ‘A’ staat hierbij voor het dominante allel en ‘a’ voor het recessieve. De pijlen geven de verschillende restrictie-sites op het DNA aan, hier zal het DNA door de restrictie-enzymen worden geknipt. Het dikkere stuk lijn is de complementaire, fluorescerende DNA probe die aan het DNA target is gaan zitten. Bij het recessieve allel is door middel van een mutatie een restrictie-site verdwenen, waardoor de fluorescerende DNA probe, na opknippen van het DNA, op een groter stuk DNA zit dan op die van het dominante allel. Na Southern blotting zal het grotere stuk DNA van het recessieve allel dus minder ver door de gel heen zakken dan het kleinere stuk van het dominante allel.
Doordat beide stukken DNA (A en a) een fluorescerende probe bevatten, kunnen de stukken worden herkend op de restrictiekaart. Als hier een verschil zit tussen fluorescerende streepjes, is er sprake van verschillende allelen (figuur 5). Homozygote individuen zullen op een restrictiekaart maar één fluorescerend streepje krijgen. Dit in tegenstelling tot heterozygote individuen, die voor beide allelen een fluorescerend streepje zullen krijgen. Met RFLP kun zou je dus mutaties kunnen aantonen, door bepaalde stukken DNA van een persoon te vergelijken met die van iemand anders.
Conclusie Huidkanker is een veel voorkomende kanker, die mogelijk veroorzaakt wordt door UV-straling. Jaarlijks sterven veel mensen als gevolg van huidkanker. Daarom is het belangrijk dat huidkanker in een vroeg stadium herkend wordt. Wij hebben onderzocht of RFLP een goede methode is om huidkanker te herkennen. Uit ons onderzoek blijkt dat je met RFLP mutaties zou kunnen opsporen. Deze mutaties moeten dan wel in restrictie-sites zitten. Omdat lang niet alle kankerverwekkende mutaties in restrictie-sites zitten, is het de vraag of dit een bruikbare onderzoeksmethode bij huidkanker is. Als er echter toch een kankerveroorzakende mutatie in een restrictie-site is, kan deze door middel van RFLP opgespoord worden. Oftewel, het is niet zeker of huidkanker te detecteren is met RFLP. Met de moderne technieken lijkt het verstandiger om een andere methode te kiezen voor het opsporen van de genetische afwijkingen bij huidkanker.